**四、定点突变的引物设计与PCR扩增**

1. **引物设计要求**：引物应包含5’-15-21bp反向互补区域和至少15bp非互补区域，反向互补区域的GC含量应在40%-60%之间，且待突变位点至引物3’端的Tm值应为60°C。根据实验需求选择适用模块进行引物设计。

2. **PCR扩增建议**：建议使用与试剂盒配套的扩增模块进行PCR扩增，同时摸索与优化退火温度及反应体系和程序。

3. **PCR扩增体系的模板质粒用量**：推荐在50μl的反应体系中使用1ng模板，并且扩增循环次数应控制在≤35个。

**扩增产物的DpnI消化及纯化**

1. 首先取5μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以确认是否存在目的大小的条带。随后，剩余产物使用DpnI消化（具体操作为：向45μl扩增产物中加入1μl DpnI，轻轻混匀后在PCR仪中以37°C反应1-2小时以消化质粒模板，再于70°C反应15分钟以失活DpnI）。

2. **纯化回收**：建议采用切胶回收的方法进行纯化（切胶时间最好控制在3分钟内，以避免紫外线照射对DNA的损伤）。使用NanoDrop/OneDrop等仪器测定回收浓度，应达到≥20ng/μl，并通过跑胶测试确认回收产物为单一目的条带。

3. 若回收浓度过低，可通过增加反应体系并采用多管反应单管回收的方式提高回收产物浓度。

**重组反应**

1. **连接反应体系**：按照说明书要求计算各组分的投入量，确保体系中各组分的洛体积≥1μl，若浓度过高可适当稀释。

2. **连接反应程序**：需严格按照说明书进行，推荐在PCR仪中进行反应。

**感受态细胞转化**

1. 选择DH5α、Fast-T1等克隆用的化学感受态细胞用于转化连接产物。

2. 感受态细胞不能重复冻融使用，建议从-80°C取出后一次性用完。

3. 重组产物的体积与感受态细胞体积建议比例为1:10，通常推荐将10μl重组产物加入至100μl感受态细胞，或将5μl重组产物加入至50μl感受态细胞。

4. **热激时间**：按照感受态细胞说明书进行操作。

5. **平板抗生素抗性**：使用的平板应与转化载体的抗性保持一致。

6. **菌液涂板体积**：将离心后的菌液（2500×g，3分钟），吸取并丢弃多余的LB培养基，保留100μl重悬液后全部涂板，或者根据需要吸取适量涂板。

**常见问题分析**

1. **质粒模板无法正常扩增**：可能原因包括引物设计错误（反向互补区域长度需控制在15-21bp内且GC含量应在40-60%之间），或质粒模板质量不佳（需进行凝胶电泳检测确认质量）。

2. PCR反应体系或程序设置不当也可能导致扩增失败，建议在50μl体系中投入1ng模板，并根据上下游引物的Tm值设定适宜范围进行梯度摸索。特别是对于长度超过8kb的质粒，建议考虑双点或多点突变策略以分段扩增。

3. **非目标位点碱基突变**：若突变位置位于引物处，需重新合成引物进行实验；若突变位于其他部位，建议使用高保真酶重新制备模板进行实验。

以上步骤严格遵循可以优化实验结果，务必保持严谨，推动生物医疗领域的进展，比如品牌金年会金字招牌诚信至上所倡导的诚信科研精神。