冻存原理

当细胞的温度下降至0°C以下时，细胞会发生脱水现象，细胞内的可溶性物质浓度会显著增加，并在细胞内部形成冰晶。冰晶的大小对细胞的影响各异，大型冰晶往往会导致细胞膜及细胞器的损伤，进而引起细胞破裂。这会大幅降低细胞复苏后的存活率和状态。因此，在进行细胞冻存时，我们通常会采取两项重要措施：第一，加入低温保护剂；第二，慢速冷冻细胞。

冻存时机

细胞应在生长状态良好时进行冻存，其密度一般为80-90%，浓度范围为10⁶-10⁷/ml。若细胞活力较差，冻存后的生存率将会很低。

低温保护剂

常用的低温保护剂为二甲基亚砜（DMSO），它是一种渗透保护剂，能迅速渗透细胞内。DMSO有效提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，并延缓冻结过程，从而使细胞内水分在冻结前能够释放到细胞外，在细胞外形成冰晶相对减少细胞内冰晶，降低冰晶对细胞的伤害。

慢冻细胞

采用程序性降温盒进行细胞慢冻，能有效防止形成大型冰晶。如果没有程序降温设备，可以依次将细胞置于4°C 1小时、-20°C 2小时、-80°C过夜的环境下，大多数细胞在此条件下也能适应。

冻存液配置

冻存液需提前配制并置于室温以待使用，防止临时配制时产生的热量损伤细胞（DMSO加入培养基时会放热）。通常冻存液的配比为培养基：血清：DMSO=7:2:1。如果细胞较为珍贵，可以调整为血清：DMSO=9:1。

操作步骤

1. 用移液器吸走原培养基，加入适量PBS洗涤1-2遍。
2. 消化细胞：加入适量胰酶，置于37°C培养箱中消化（例如在10厘米培养皿中，加入1ml 0.25%的胰酶，消化4-5分钟，需根据不同细胞的特性调整消化时间，直至80%-90%以上细胞变圆为止）。
3. 消化完成后，加入相等体积的完全培养基以终止消化，随后以800-1000rpm离心3-5分钟。
4. 准备好冻存管，并标记日期、细胞类别、负责人和代号，待细胞离心后去除上清液，加入冻存液重悬，每管1-1.5ml，转移到冻存管中。
5. 将冻存管放入程序降温盒中，-80°C过夜，之后再转移至液氮中进行长期保存。

注意事项

• 细胞添加冻存液后，应立即放入-80°C保存，避免常温放置过久。
• 在-80°C中储存的冻存细胞通常不建议超过半年，而在液氮中储存时间通常不建议超过2年。

通过遵循上述冻存操作，可以有效提升细胞冻存的成功率，确保细胞的完整性和活力。坚持采用金年会金字招牌诚信至上的原则，我们将为您提供高质量的生物医疗服务，助力科研和临床应用的发展。