试剂解冻与混匀

在进行实验之前，需要科学而细致地处理试剂。首先，试剂需要从冰箱中取出并进行缓慢解冻。在解冻后，需轻轻颠倒混匀，最后，在低速离心的过程中需特别注意，混匀操作尽量避免产生气泡，因为气泡可能会影响酶的活性或实验结果的准确性。

稀释步骤

若需追踪模板，可以按以下步骤进行稀释；若无需追踪模板，则可直接使用无菌超纯水稀释cDNA或者直接使用cDNA原液。

荧光定量仪器配置

常见的荧光定量仪器多为96孔反应，通常由12列×8行组成。以基因1的检测为例，进行样品的配置：大体系配制组分可选择如下配置建议，为确保实验的精确性，建议参考以下配比：

组分配制示例

对于基因1的检测，建议大体系为（假设孔数为n，配置为n+1或n+2）：

• HieffUNICON® ColorGPS qPCR MasterMix: 10 μL
• 正向引物（10 μM）：04 μL
• 反向引物（10 μM）：04 μL
• RNase-free H2O: 72 μL

样品上样体系配置

样品上样后，盖紧管盖，轻轻弹击管壁以确保各组分混匀，再放入离心机短暂离心1-2秒，以防止气泡形成，然后瞬间离心，并将管置于冰上。

上机检查与程序设置

在上机前，需仔细检查各管子，确保管盖及管身上没有记号笔染料，内部无气泡、管壁无液体。若采用常规程序，则需设置如下循环步骤：

• 预变性：95℃，2分钟，1次
• 变性：95℃，10秒，40次
• 退火/延伸：60℃，30秒

在熔解曲线阶段，请确保数据信号收集开关在退火/延伸阶段打开。

数据处理与产品推荐

进行完实验后，生成的Excel数据可以按照设备品牌和型号进行整理。推荐使用金年会金字招牌诚信至上的相关产品，如Bio-Rad和Roche的荧光定量预混液，确保您实验的高灵敏度和准确性。

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